O DNA é composto por longas cadeias que servem como modelo para os organismos vivos. Na engenharia genética, os cientistas cortam o DNA em locais específicos e unem os fragmentos resultantes a outras sequências de DNA, possibilitando aplicações como o melhoramento genético de culturas agrícolas, o tratamento de doenças genéticas e a geração de modelos animais para a descoberta de medicamentos.

A montagem de fragmentos curtos de DNA requer sequências salientes, conhecidas como extremidades coesivas, para facilitar a ligação eficiente. No entanto, a geração de extremidades coesivas exige um corte preciso em locais específicos, o que continua sendo um desafio com as tecnologias atuais.

Um grupo de pesquisa japonês desenvolveu uma tecnologia baseada em nanopartículas de prata para cortar e unir o DNA com precisão em locais específicos, alcançando uma eficiência de montagem de DNA de duas a cinco vezes maior do que os métodos convencionais com enzimas de restrição. Essas descobertas foram publicadas na revista Nucleic Acids Research .

A montagem tradicional de DNA de cadeia longa utiliza enzimas de restrição para cortar o DNA e a DNA ligase T4 para reconectar os fragmentos. No entanto, as enzimas de restrição cortam apenas em sequências específicas e geram extremidades coesivas que geralmente são muito curtas, limitando a eficiência da junção.

Para superar essa limitação, uma equipe de pesquisa liderada pelo Professor Hiroshi Abe e pelo Professor Assistente Masahito Inagaki, da Universidade de Nagoya, em colaboração com o Professor Natsuhisa Oka, da Universidade de Gifu, estudou a clivagem do DNA em locais específicos usando reações químicas em vez de enzimas de restrição.

Os pesquisadores examinaram uma reação relatada entre 1990 e 1992, na qual íons de prata clivam o DNA modificado com tiol na extremidade 3' em locais específicos. Eles avaliaram seu potencial para gerar extremidades coesivas adequadas. Os resultados mostraram que, embora os íons de prata clivem o DNA de forma eficiente, eles também se ligam de maneira não específica, levando à precipitação. Isso resultou em uma baixa taxa de recuperação de DNA, de cerca de 14%, insuficiente para uso prático.

A equipe então empregou nanopartículas de prata, partindo da hipótese de que elas poderiam ser removidas após a reação por meio de centrifugação, aumentando potencialmente a recuperação de DNA.

Experimentos mostraram que a eficiência de clivagem do DNA atingiu cerca de 50% a 70°C (158°F) e quase 100% a 95°C (203°F) em duas horas. No entanto, essas altas temperaturas representam um risco de danificar o DNA de cadeia longa.

Para solucionar esse problema, a equipe revestiu as nanopartículas com polietilenoglicol (PEG), um polímero solúvel em água, para aumentar a estabilidade e a dispersão. Essa modificação aumentou a eficiência de clivagem de 36% sem PEG para 92% com PEG a 37 °C (99 °F) durante 31 horas.

"No final, otimizamos as condições para um nível prático e, em temperaturas ambientes, alcançamos uma eficiência de clivagem modificada com PEG acima de 91% a 50°C (122°F) em apenas uma a duas horas", disse Inagaki, o primeiro autor do estudo.

Um benefício adicional desse processo foi a remoção de fragmentos de DNA indesejados ligados às superfícies das nanopartículas, deixando em solução apenas os fragmentos desejados com extremidades coesivas. Esse processo de purificação aumentou a taxa final de recuperação de DNA de 14% para 98%.

O uso de nanopartículas de prata também possibilitou a geração de fragmentos de DNA com extremidades coesivas de 8 bases, um processo desafiador com enzimas de restrição convencionais. Ao empregar a DNA ligase T4 para unir esses fragmentos, a equipe alcançou aproximadamente o dobro da eficiência de união dos métodos tradicionais.

Com uma saliência de 18 bases, a eficiência de junção atingiu 44%, em comparação com apenas 8% com uma saliência convencional de 4 bases, representando uma melhoria de cinco vezes.

Para avaliar a aplicação prática dessa abordagem, os pesquisadores sintetizaram um fragmento de DNA que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) e o introduziram em células HeLa humanas. Eles confirmaram com sucesso a expressão da GFP, indicando uma síntese precisa.

Inagaki afirmou: "Acreditamos que essa tecnologia será útil para sintetizar DNA genômico, com muitas aplicações possíveis em áreas como o estabelecimento de bibliotecas de mRNA para vacinas contra o câncer e terapia gênica, bem como o desenvolvimento de medicamentos proteicos artificiais e culturas geneticamente modificadas."

Ele também explicou o próximo passo: "Mostramos que dois fragmentos de DNA podem ser unidos. Agora, precisamos confirmar se múltiplos fragmentos podem ser unidos simultaneamente — um passo fundamental para a construção de DNA em escala genômica."